Химическая энциклопедия - ферментативные методы анализа

основаны на использовании хим. р-ций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол-ву конечного продукта ферментативной р-ции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. Кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной р-ции применяют обычно инструментальные методы, чаще других люминесцентные, спектрофотометрич., электрохимические. Достоинства Ф. м. а.: высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных р-ций (с помощью к-рых определяют в-во) и способами детекции аналит. сигнала; высокая селективность и мягкие условия проведения анализа.

Определяемым компонентом в Ф. м. а. могут быть субстраты (в-ва, превращение к-рых катализирует фермент), сами ферменты, коферменты (в-ва, необходимые для осуществления каталитич. действия фермента) и эффекторы (соед., изменяющие каталитич. активность фермента активаторы, ингибиторы). Среди коферментов НАД и НАДН (соотв. никотинамидадениндинуклеотид и его восстановленная форма), НАДФ и НАДФН (соотв. никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат и его восстановленная форма), АТФ (аде-нозинтрифосфат) и др.

Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетич. характеристик используемой индикаторной ферментативной р-ции и, прежде всего, каталитич. активности фермента.

Фермент катализирует р-ции, в к-рых участвуют, как правило, один или два субстрата. В односубстратной р-ции концентрация субстрата [S]0 пропорциональна скорости процесса v0 только при условии [S]0 К м, > где К м -> константа Михаэлиса. Следовательно, верхняя граница определяемых содержаний лимитируется, как правило, величиной К м. > Предел обнаружения и ниж. граница анализируемых содержаний субстрата определяются обычно той величиной v0, к-рая м. б. зафиксирована выбранным инструментальным методом. Чем меньше величина v0 и чем выше каталитич. константа скорости k кат и концентрация [E]0 фермента, тем ниже предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний субстрата. Для двусубстратных р-ций при определении субстрата S1 субстрат S2 берется в насыщенных концентрациях и двусубстратная р-ция сводится к одно-субстратной.

В случае обратимого неконкурентного инги-бирования фермента ингибиторы I, взаимодействуя с ферментом, образуют каталитически неактивные комплексы EI. Для ингибиторов этого типа верхняя граница определяемых содержаний лимитируется величиной KI =[EI] ; предел [E][I] обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний зависят также и от концентрации фермента. Такие же зависимости сохраняются и при определении обратимых активаторов ферментов.

В случае необратимого ингибирования ферментативных р-ций ниж. граница определяемых содержаний ингибитора зависит от времени ингибирования. Если значение константы скорости этого процесса k ин невелико, относит. уменьшение активности фермента зависит от длительности процесса ингибирования. При достаточно больших k ин временной зависимостью можно пренебречь, тогда относит. уменьшение активности фермента пропорционально концентрации ингибитора: = n[I], где n - число молекул ингибитора, взаимодействующего с одной молекулой фермента.

В Ф. м. а. часто используют системы, состоящие из неск. сопряженных р-ций, катализируемых разл. ферментами. Так, напр., в случае системы из двух р-ций продукты первой ферментативной р-ции являются субстратами для второй ферментативной р-ции (индикаторной), что позволяет повысить чувствительность определения того или иного соед. и при необходимости изменить способ детекции. Так, напр., для определения глюкозы применяют р-цию ее окисления кислородом воздуха до глюконовой к-ты и H2O2, катализируемую глюкозооксидазой. Для контроля за скоростью процесса используют электрохим. методы, наблюдая за уменьшением кол-ва кислорода в р-ре с помощью О 2 -чувствительного электрода Кларка или измеряя рН р-ра. Миним. содержание глюкозы, к-рое можно определять этими способами детекции, 0,01-0,03 мМ. Применяя биферментативные сопряженные р-ции для определения глюкозы, контролируют кол-во образовавшегося H2O2, напр. по р-ции окисления пероксидом водорода в присут. пероксидазы о-дианизидина (3,3'-диметок-сибензидина) с образованием окрашенного в-ва или люмино-ла с образованием люминесцирующего соединения. Спектрофотометрич. или люминесцентный методы контроля позволяют определять содержание глюкозы соотв. 2 мкМ и 20 нМ.

Как правило, чувствительность определения ферментов, коферментов и эффекторов выше, чем чувствительность определения субстратов. Напр., возможно определение 0,001 пМ содержания АТФ, 0,1 нМ ионов Hg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, 0,1 мкМ тиомочевины и меркаптоэтанола. Однако ряд субстратов определяют также при очень малых содержаниях, особенно при хемиили биолюминесцентной (см. ниже) регистрации аналит. сигнала: 0,1 нМ H2O2, 0,01 нМ мочевины. Чувствительность определения мн. в-в Ф. м. а. часто более высока, чем чувствительность определения этих же компонентов любыми др. методами.

Высокая селективность Ф. м. а. обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса в процессе каталитич. акта, требующим структурного соответствия активного центра фермента и субстрата. Поэтому большинство ферментов активно только в р-циях с субстратом одного определенного типа или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Напр., фермент глюкозооксидаза катализирует окисление практически только одного вида глюкозы -глюкозу, к-рую можно определять без разделения сложной смеси моно-и олигосахаридов. В данном случае проявляется субстратная специфичность фермента.

Групповую специфичность можно наблюдать в случае действия альдегидоксидазы в р-циях превращения алифатич. альдегидов. Значительно менее селективны методы определения эффекторов, т. к. обычно имеется группа разл. соед., в той или иной степени меняющих каталитич. активность данного фермента. Однако селективность определения эффекторов м. б. и очень высокой. Так, очень малые кол-ва ртути (10 пМ) можно определять по ее ингибирующему действию на пероксидазу хрена на фоне тысячекратных кол-в Bi и Cd и значительно больших кол-в мн. неорг. и орг. в-в.

Использование иммобилизованных ферментов. Недостатки Ф. м. а. обусловлены рядом особенностей ферментов: потерей функциональной активности и стабильности ферментов под воздействием разл. факторов; высокой стоимостью из-за невозможности многократного использования растворимых ферментов и трудности их выделения и очистки. Применение иммобилизованных ферментов расширило возможности Ф. м. а. Более высокая стабильность и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов позволили снизить стоимость анализов, повысить экспресс-ность, проводить хим. анализ в потоке и автоматизировать ферментативные методы. Впервые иммобилизованные ферменты в хим. анализе применили в сер. 60-х гг. 20 в. Для обнаружения фосфорорг. пестицидов в воздухе использовали холинэстеразу, включенную в крахмальный гель, нанесенный на полиуретановую пластинку. С помощью глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы, включенных в полиакриламидный гель, определяли соотв. глюкозу или молочную к-ту.

Помимо единичных иммобилизованных ферментов, в хим. анализе используют соиммобилизованные ферментные системы, позволяющие повышать чувствительность и селективность определения. При этом все чаще применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащие естественный набор ферментов. Преимущество такой иммобилизации состоит в том, что исключаются стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, увеличивается их стабильность. Иммобилизацию используют не только для ферментов, но и для субстратов, коферментов и эффекторов.

Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментамиколонки, трубки, полые нити. Для заполнения колонок применяют обычно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, найлоновым порошком, силикагелем и т. д. Один из лучших носителей для колоночных реакторов ссфароза, активированная бромци-аном. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2-20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержащую соиммобилизованные на бромциан-сефаразе триптофаназу и лактатдегидрогеназу.

В трубчатых реакторах фермент ковалентно иммобилизуется на внутр. пов-сти найлоновой трубки, длина к-рой варьирует от 1 до 3 м. С помощью таких реакторов, прокачивая через них анализируемый р-р, определяют, напр., в сыворотке крови мочевину, мочевую к-ту, аминокислоты, глюкозу, лактозу, мальтозу, пенициллин.

Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формования. Фермент оказывается включенным во внутр. полость, куда могут проникать только низкомол. субстраты. Эти нити накручивают в виде катушек, заключают в стеклянную оболочку и через такой бобинный ферментный реактор пропускают анализируемую смесь, напр., при определении пенициллина, мочевины или глюкозы.

Скорость пропускания потока смеси р-ров, содержащих анализируемую пробу и реагенты, через реакторы устанавливают такой, что после прохождения через ферментный реактор р-ция либо заканчивается (при анализе по конечному продукту), либо протекает до определенной глубины (скорость обычно определяют способом фиксированного времени).

Разновидности Ф. м. а. Среди наиб. чувствительных Ф. м. а. особое место занимают би о люминесцентные методы (см. Люминесцентный анализ}. Чаще других используют процессы, катализируемые ферментом люциферазой светляков. Система включает люциферин (ф-ла 1, люциферин светляка), к-рый в присут. АТФ подвергается катализируемому люциферазой окислению кислородом с образованием люминесцирующего в-ва. Высокий квантовый выход биолюминесценции, применение полиферментных сопряженных р-ций позволяет определять нек-рые соед. при концентрации 0,001-0,1 пМ.

Один из важных Ф. м. а.анализ с использованием ферментных электродов, к-рые сочетают высокую селективность биокатализа и совершенную технику электрохим. методов. В простейшем варианте расгворимый фермент помещают между двумя полупроницаемыми мембранами; одна отделяет р-р фермента от электродного датчика, другая от анализируемого р-ра. Однако чаще ферменты иммобилизуют, включая их в полимерные или гелевые пленки альбумина, желатины, агар-агара, коллагена, гидроксида Al или ковалентно присоединяя к пов-сти стеклянных дисков, полупроницаемых мембран (целлюлозных, поликарбонатных). Пленки прикрепляют к пов-сти электрода. Часто такую пленку (мембрану) готовят непосредственно на пов-сти электрода. Субстрат диффундирует через слой, содержащий фермент, образуя электроактивное в-во, детектируемое при помощи потен-циометрич. или амперометрич. датчика.